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Epitopes : structure et homologies

vendredi 21 novembre 2008, par Allerdata

Ce sont surtout les épitopes B qui ont été étudiés.

On sait cependant que les épitopes T :

  • ne sont pas obligatoirement superposés aux épitopes B sur la protéine
  • sont peu dépendants de la conformation native de la protéine
  • peuvent être situés dans des zones internes de la protéine
  • peuvent être l’objet d’une liaison croisée au niveau des cellules T, à l’image des réactions croisées de deux épitopes B vis à vis de la même IgE
  • présentent une large variabilité de positionnement sur la protéine d’un patient à un autre

Cette variabilité individuelle est retrouvée pour les épitopes B.

Ainsi, non seulement les patients diffèrent les uns des autres par leurs contacts avec tel ou tel produit allergisant (ex. pollens, aliments), mais ils ne se sensibilisent pas tous au même produit, ni aux mêmes allergènes dans un produit donné, ni aux mêmes isoformes d’un allergène donné, ni aux mêmes épitopes d’un même allergène !

Un travail de Fujimura explicite clairement cette hétérogénéité  :

  • le sérum de 40 patients polliniques a révélé pas moins de 131 spots IgE-réactifs différents en immunoblot du pollen du cèdre du Japon (Cryptomeria japonica)
  • le nombre de patients reconnaissant le même spot varie de 1 à 31 selon les spots
  • le nombre de spots reconnus chez le même patient varie de 4 à 86 (cf. figure ci-dessous, reproduite avec l’aimable autorisation de T. Fujimura)
  • et les 12 isoformes de Cry j 1 étaient détectées dans une proportion très variable (dans 27 à 75% des cas) alors que ces isoformes ont une très forte homologie entre elles.

Comment repère-t-on la présence et le positionnement des épitopes B sur un allergène ?

Classiquement, différentes méthodes peuvent être utilisées :

  • coupure de la protéine en plusieurs morceaux puis tests d’IgE-réactivité résiduelle sur chacun d’eux. Selon les points de coupure, c’est-à-dire selon le type de protéase utilisée, on peut repérer des zones qui conservent dans tous les cas une IgE-réactivité : celles-ci sont des “points chauds” de l’IgE-réactivité de la protéine
  • modification ponctuelle d’un ou quelques acides aminés afin de tester un changement d’IgE-réactivité. Ces techniques de mutation dirigée utilisent donc des protéines recombinantes.
  • étude de la séquence linéaire de la protéine, puis synthèse de courts peptides (env 12 amino-acides) qui sont la réplique de toute la protéine d’un bout à l’autre. C’est l’ “epitope mapping”. Pour ne pas manquer un épitope les peptides se recouvrent les uns les autres, on parle de “peptides chevauchants” (cf. figure ci-dessous)

Mais ces techniques pour repérer les épitopes B ont un grave défaut : elles ne respectent pas la conformation native de la protéine.

Or, tous les experts s’accordent à présent pour estimer que dans la grande majorité des cas les épitopes B ne sont pas “linéaires” mais “conformationnels”.

Qu’est-ce qu’un épitope conformationnel ?

Un épitope est conformationnel à partir du moment où les acides aminés nécessaires à son IgE-réactivité ne sont pas côte à côte le long de la séquence peptidique. On parle aussi d’épitope “discontinu”.

C’est le repliement de la protéine sur elle-même qui est responsable du rapprochement d’acides aminés a priori distants les uns des autres.

Un épitope conformationnel correspond donc à une zone en surface de la protéine.

Les caractéristiques spatiales de ces épitopes sont dès lors très importantes et une modification touchant un acide aminé (ex. mutation dirigée) ou l’équilibre tridimentionnel de la protéine (ex. effet de la chaleur) sont susceptibles de perturber la capacité de liaison de l’épitope aux IgE.

Pour les protéines qui ne subissent pas de transformation avant le contact avec le patient, il est préférable de déterminer les épitopes B en s’éloignant le moins possible de la forme native de l’allergène. Cela concerne les allergènes aéroportés notamment.

Une technique tend à répondre à cette exigence, la “présentation par phages” (ou “phage display”) . Cette approche associe des moyens informatiques et des tests de laboratoire.

En bref :

  • on commence par sélectionner les IgE qui se lient à l’allergène à tester ; puis on teste ces IgE avec une “bibliothèque” de bactériophages filamenteux qui expriment à leur surface de courts peptides de séquence quelconque
  • les clones de bactériophages qui s’avèrent montrer une IgE-réactivité sont sélectionnés et peu à peu purifiés
  • l’analyse de leur ADN identifie la séquence d’acides aminés du peptide présenté
  • cette dernière est alors reportée sur un modèle en 3D de l’allergène ; la coalescence de ces zones IgE-réactives en surface de l’allergène définit la position de l’épitope conformationnel.

Cette technique est d’une grande importance pour mieux appréhender les similitudes responsables des réactivités croisées entre allergènes et, possiblement, pour prédire l’éventuelle IgE-réactivité d’une nouvelle protéine (cf. Prédictabilité des allergènes).

La figure ci-dessous, reproduite avec l’aimable autorisation d’Erwin L. Roggen (elro@novozymes.com), montre le positionnement d’épitopes conformationnels sur la molécule d’Ara h 2, une 2S albumine présente dans l’arachide

Les résultats obtenus en “epitope mapping” sont représentés verticalement à gauche : il a été trouvé 10 épitopes séquentiels, montrés ici avec chacun une couleur différente. La technique de présentation par phages retrouve une grande partie de ces régions IgE-réactives, mais montre clairement que les épitopes sont le plus souvent formés par le rapprochement de plusieurs courtes séquences IgE-réactives en surface de la protéine. Cela est particulièrement net pour les épitopes conformationnels figués en rouge et orange.

La modélisation 3D permet donc une caractérisation plus pertinente des épitopes B. Elle aide aussi à comprendre les fines différences qui modifient l’IgE-réactivité de protéines pourtant globalement très similaires.

Il en est de même pour la réactivité croisée .

De plus, l’assemblage de certaines protéines sous la forme de trimères ou d’hexamères peut entraîner le masquage de certains épitopes, ces derniers se retrouvant “enfouis” ou peu accessibles dans la protéine complète. Ceci a été particulièrement bien montré par les travaux de l’équipe toulousaine d’Annick Barre sur les allergènes d’arachide .

[1] - Fujimura T, Shigeta S, Kawamoto S, Aki T, Masubuchi M, Hayashi T, et al. Two-Dimensional IgE-Binding Spectrum of Japanese Cedar (Cryptomeria japonica) Pollen Allergens. Int Arch Allergy Immunol 2004;133:125-135
BACKGROUND: Japanese cedar (Cryptomeria japonica) pollen is one of the most prevalent sources of the allergens that elicit rhinitis and conjunctivitis. Only Cry j 1 and Cry j 2 have been well characterized as the major allergens of this pollen . OBJECTIVES: The aims of this study were to complete the repertoire of C. japonica pollen allergens, to investigate their variability with respect to IgE-reactive patterns and to identify the isoforms of Cry j 1 and Cry j 2 by proteome analysis . METHODS: Proteins in C. japonica pollen separated on two-dimensional (2-D) polyacrylamide gel electrophoresis were immunodetected with IgE in sera of 40 subjects allergic to C. japonica pollen. Mass fingerprinting was used to elucidate the diversity of the major allergens . RESULTS: 2-D immunolabeling with individual patients' sera showed the distinguishable IgE-binding patterns inlaid with 4-87 spots from a total of 131 IgE-binding protein spots. At least 12 Cry j 1 (27.5-75% of IgE-binding frequency) and 3 Cry j 2 (32.5-40%) isoforms were localized. In total, 31 spots were found to be more reactive than the highest IgE-reactive isoform of Cry j 2 . CONCLUSIONS: The proteomics approaches showed great interindividual variation of IgE-binding patterns to C. japonica proteins and contributed to the repertoire of numerous C. japonica allergens other than Cry j 1 and Cry j 2. Protein microsequencing demonstrated more complicated multiplicity in Cry j 1 than previously known and new isoforms in Cry j 2.
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[2] - Rhyner C, Weichel M, Fluckiger S, Hemmann S, Kleber-Janke T, Crameri R. Cloning allergens via phage display. Methods 2004;32:212-218
Although an impressive list of allergenic structures has been elucidated during the last decade by classical cloning methods, the size of the repertoire of molecular structures able to elicit allergic reactions is still unknown. Selective enrichment of cDNA libraries displayed on phage surface with serum IgE from allergic individuals combined with robotic-based high-throughput screening technology has proved to be extremely successful for the rapid isolation of allergens. The basic concept of linking the phenotype, expressed as gene product displayed on the phage coat, to its genetic information integrated into the phage genome, creates fusion proteins covalently associated with the infectious particle itself. Therefore, cDNA libraries displayed on phage surface can be screened for the presence of specific clones using the discriminative power of affinity purification. The selection of IgE-binding clones involves the enrichment of phage binding to serum IgE immobilised to a solid phase during consecutive rounds of affinity selection. As a consequence of the physical linkage between genotype and phenotype, sequencing of the DNA of the integrated section of the phage genome can readily elucidate the amino acid sequence of the surface-displayed allergen. In spite of some biological limitations imposed by Escherichia coli as expression host, phage surface display technology has strongly contributed to the rapid isolation of a vast variety of IgE-binding structures.
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[3] - Batori V, Taboureau O, Friis EP, Lepp U, Becker WM, Roggen EL. Determination of conformational IgE binding epitopes on the surface of the major peanut allergen ara h 2. EAACI 23th Congress, Amsterdam, 12-16 June, 2004, Poster n°1013
Background: Identification and classification of IgE binding epitopes may explain factors leading to allergenicity and its use may guide pharmacological enzyme application. The peanut allergen Ara h 2 is recognized by the majority of patients with peanut allergy. The protein has been found remarkably stable and its structure implicated in its allergenicity. Sofar only sequential epitopes were identified using well-established techniques. There is a lack of fast methods and a three-dimensional structure to determine clinically relevant conformational epitopes. Methods: We present an application of phage display technology to determine a near complete set of conformational IgE binding epitopes to an allergen on a single patient basis. Peptide mimics that resemble an IgE binding epitope are isolated from a random peptide library due to affinity to immobilized IgE, and specifically eluted by competition with allergen. Binding of individual phage-displayed peptides to serum IgE is confirmed by ELISA, and peptides are sequenced. All mimics identified by phage display are then individually screened ("mapped") for a matching surface on a protein structure for Ara h 2 developed by homology modelling and molecular dynamics simulation. The obtained surface patches cluster to define epitopes for serum IgE of the individual patient's serum. Results and Discussion: We investigated IgE from serum of an anaphylactic patient allergic to peanuts. The IgE, that exhibited an intense reaction to Ara h 2 in Western blots, recognized three linear epitopes in the N-terminal half of the protein when tested with a SPOT library corresponding to the linear epitopes 3, 6 and 7 as defined by Stanley et al. Two of these three linear epitopes were again recognized in the phage display selections, but in addition to that, two new conformational epitopes are identified as well: a region including Epitope 9 was identified, where each individual, mimicked surface patch contained a substantial number of residues outside of the linear peptide, so that serum IgE could not recognize the linear peptide alone. A further region in the C-terminal half of the protein formed a conformational epitope that was not detected by sequential peptides. This method of observing IgE binding epitopes on a single patient basis should be broadly applicable for determination of those epitopes relevant in individual patients' allergies.
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[4] - Karisola P, Kotovuori A, Poikonen S, Niskanen E, Kalkkinen N, Turjanmaa K, et al. Isolated hevein-like domains, but not 31-kd endochitinases, are responsible for IgE-mediated in vitro and in vivo reactions in latex-fruit syndrome. J Allergy Clin Immunol 2005;115:598-605
BACKGROUND: Individuals with natural rubber latex allergy often have immediate reactions to plant-derived foods and fresh fruits, such as avocado and banana. IgE of these patients has been shown to bind endochitinases containing an N-terminal hevein-like domain (HLD). However, evidence on 31-kd endochitinase-induced reactions in vivo is lacking . OBJECTIVE: We sought to assess the clinical significance of 31-kd endochitinases and isolated HLDs in latex-fruit syndrome . METHODS: The 31-kd endochitinases and corresponding HLDs were purified or produced from avocado, banana, latex, and wheat germ. Skin prick test reactivities against purified proteins were examined in 15 patients with natural rubber latex allergy. The binding efficiency of IgE to purified proteins was studied by using an inhibition ELISA. Experimentally resolved or modeled structures of the proteins were compared to clarify the molecular basis of clinical reactions . RESULTS: Eleven (73%) patients had skin prick test reactions to isolated HLDs of avocado and banana, but only 1 (7%) patient reacted to their corresponding 31-kd endochitinases. HLDs from avocado and banana inhibited binding of IgE to prohevein (Hev b 6.01) in 59% and 38% of patients, respectively, whereas corresponding percentages for 31-kd endochitinases were 17% and 20%, respectively. Isolated HLDs of wheat germ agglutinin and 18-kd wheat germ agglutinin did not significantly inhibit IgE binding to hevein . CONCLUSION: The isolated HLD molecules alone, but not when linked to endochitinases, seem to be responsible for IgE-mediated clinical reactions in latex-fruit syndrome. Careful selection of relevant allergens in their proper molecular form is therefore crucial in forming a reliable diagnosis of latex-fruit syndrome.
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[5] - Barre A, Borges JP, Rougé P. Molecular modelling of the major peanut allergen Ara h 1 and other homotrimeric allergens of the cupin superfamily: a structural basis for their IgE-binding cross-reactivity. Biochimie 2005;87:499-506
Three-dimensional models of the major vicilin allergens from peanut (Ara h 1), lentil (Len c 1) and pea (Pis s 1), were built by homology-based modelling from the X-ray coordinates of the structurally closely related soybean beta-conglycinin. All the allergen monomers exhibit the typical cupin motif made of two modules related by a pseudo-dyad axis. Each module consists of a beta-barrel core domain associated to a loop domain which mainly contains alpha-helices. The three cupin motifs are assumed to be arranged in a homotrimeric structure similar to that observed in beta-conglycinin, phaseolin or canavalin. Most of the sequential B-cell epitopes characterized on the C-terminus of the Ara h 1 allergen are well conserved in both Len c 1 and Pis s 1 allergens. They occupy very comparable areas on the molecular surface of the allergens and exhibit a similar three-dimensional conformation. This antigenic community readily accounts for the IgE-binding cross-reactivity commonly observed between the vicilin allergens from edible legume seeds. The clinical implication of this cross-reactivity is addressed for a definite diagnosis of legume seed allergy.
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[6] - Barre A, Sordet C, Culerrier R, Rancé F, Didier A, Rougé P. Vicilin allergens of peanut and tree nuts (walnut, hazelnut and cashew nut) share structurally related IgE-binding epitopes. Mol Immunol 2008;45:1231-1240
Surface-exposed IgE-binding epitopes of close overall conformation were characterized on the molecular surface of three-dimensional models built for the vicilin allergens of peanut (Ara h 1), walnut (Jug r 2), hazelnut (Cor a 11) and cashew nut (Ana o 1). They correspond to linear stretches of conserved amino acid sequences mainly located along the C-terminus of the polypeptide chains. A glyco-epitope corresponding to an exposed N-glycosylation site could also interfere with the IgE-binding epitopes. All these epitopic regions should participate in the IgE-binding cross-reactivity commonly reported between tree nuts or between peanut and some tree nuts in sensitized individuals. Owing to this epitopic community which constitutes a risk of cross-sensitization, the avoidance or a restricted consumption of other tree nuts should be recommended to peanut-sensitized individuals.
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[7] - Barre A, Jacquet G, Sordet C, Culerrier R, Rougé P. Homology modelling and conformational analysis of IgE-binding epitopes of Ara h 3 and other legumin allergens with a cupin fold from tree nuts. Mol Immunol 2007;44:3243-3255
Linear IgE-binding epitopes identified in legumin allergens of peanut (Ara h 3) and other allergenic tree nuts (Jug r 4 of walnut, Cor a 9 of hazelnut, Ana o 2 cashew nut) were mapped on three-dimensional models of the proteins built up by homology modelling. A conformational analysis revealed that consensual surface-exposed IgE-binding epitopes exhibited some structural homology susceptible to account for the IgE-binding cross-reactivity observed among peanut and tree nut allergens. This structurally related cross-reactivity seems irrespective of the botanical origin of the allergens and thus demands that persons allergic to peanut avoid other three nuts to prevent possible allergic reactions. IgE-binding epitopes similar to those found in 11S globulin allergens do not apparently occur in other vicilin allergens with the cupin fold from peanut (Ara h 1) or tree nuts (Jug r 2 of walnut, Cor a 1 of hazel nut, Ana o 3 of cashew nut).
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